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細胞裂解決辦法
發布時間:2019/12/27 9:16:36 閱讀次數:165

     關于培養細胞樣品:

 
    1.融解ripa裂解液,混勻。取恰當量的裂解液,在運用前數分鐘內參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
 
    2.關于貼壁細胞:去除培養液,用pbs、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(假如血清中的蛋白沒有干擾,能夠不洗)。按照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充沛接觸。一般裂解液接觸細胞1-2秒后,細胞就會被裂解。
 
    關于懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。再用手指輕彈以充沛裂解細胞。充沛裂解后應沒有明顯的細胞沉積。假如細胞量較多,必需分裝成50-100萬細胞/管,然后再裂解。
 
    3.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進行后續的page、western和免疫沉積等操作。 
 
    裂解液用量說明:一般6孔板每孔細胞參加150微升裂解液現已足夠,但假如細胞密度十分高能夠恰當加大裂解液的用量到200微升或250微升。 
 
    關于安排樣品: 
 
    1.把安排剪切成細微的碎片。
 
    2.融解ripa裂解液,混勻。取恰當量的裂解液,在運用前數分鐘內參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
 
    3.按照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當增加更多的裂解液,假如需求高濃度的蛋白樣品,能夠恰當減少裂解液的用量。)
 
    4.用玻璃勻漿器勻漿,直至充沛裂解。
 
    5.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進行后續的page、western和免疫沉積等操作。
 
    6.假如安排樣品本身十分細微,能夠恰當剪切后直接參加裂解液裂解,通過激烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清,用于后續試驗。直接裂解的優點是比較方便,不用運用勻漿器,缺陷是不如運用勻漿器那樣裂解得比較充沛。 
 
    注:ripa裂解液的裂解產品中經常會出現一小團通明膠狀物,屬正常現象。該通明膠狀物為含有基因組dna等的復合物。在不檢測和基因組dna結合特別緊密的蛋白的情況下,能夠直接離心取上清用于后續試驗;假如需求檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則能夠通過超聲處理打碎打散該通明膠狀物,隨后離心取上清用于后續試驗。假如檢測一些常見的轉錄因子,例如nf-kappab、p53等時,一般不用進行超聲處理,就能夠檢測到這些轉錄因子。
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